Isolasi Limfosit

Isolasi Limfosit Mencit Balb/c    Sel limfosit diisolasi dari limpa mencit Balb/c umur 6-8 minggu dalam suasana aseptik menurut Depamede (2006). Sel-sel limpa diambil dengan cara menoreh salah satu ujung limpa dan menyutikkan medium RPMI (Gibco, BRL) ke bagian ujung lain dari limpa yang diletakkan pada cawan petri yang berisi medium RPMI. Sel-sel yang diperoleh ditampung dalam tabung kemudian disentrifus (Labofuge 400 Heraeus Instruments) pada 2000 x g selama 5 menit pada suhu kamar. Pelet yang terbentuk disuspensikan dengan larutan NH4Cl 0,17 M sebanyak 5 ml/1 limpa, untuk melisiskan sel-sel darah merah selama 5 menit, pada suhu kamar. Selanjutnya disentrifugasi 2000 x g, 5 menit, pada suhu kamar, kemudian larutan NH4Cl dan lisat sel-sel darah merah dibuang. Pelet berupa sel-sel limfosit dicuci dengan medium RPMI sebanyak dua kali dengan cara sentrifugasi 2000 x g, 5 menit, pada suhu kamar. Limfosit yang telah dicuci diresuspensi dengan medium tumbuh yaitu RPMI yang mengandung fetal bovine serum 10%, antibiotik penisilin 100 IU/ml, streptomisin 100 μg/ml (Gibco, BRL), dan L-glutamin 2 mM (Gibco,BRL).     Uji Penghambatan dan Netralisasi Penghambatan Proliferasi Kultur Limfosit     Uji ini dilakukan menurut Veselsky et al. (2003) dan Depamede (2006) dengan beberapa modifi kasi. Pengujian dilakukan dengan cara mengkultur 25x104 sel limfosit per sumuran plat mikro 96 sumuran (Nunc Clone). Sebagai kontrol proliferasi tanpa perlakuan, ke dalam sumuran yang telah terisi sel limfosit ditambahkan concanavalin A (Con A, Type V-A, Sigma) atau rekombinan murin interlukin 2 (IL-2, BioVision) masing-masing dengan konsentrasi akhir 10 μg/ml dan 0.2 ng/ml sebagai pemicu proliferasi. Selain ditambahkan Con A atau IL-2, untuk perlakuan penghambatan oleh ET, ke dalam sumuran yang telah berisi sel limfosit juga ditambahkan ET dengan konsentrasi 40, 20, dan 10 μg/ml. Uji netralisasi atau anulir penghambatan dilakukan dengan menambahkan anti TGF-β1 policlonal antibody (BioVision) yang spesifi k terhadap TGF-β1 bovine, dengan konsentrasi akhir 1 μg/ml, ke dalam sumuran yang berisi sel limfosit, Con A, dan ET (20 μg/ml). Volume fi nal setiap sumuran adalah 200 μl pada semua pengujian. Plat mikro yang telah berisi sel kemudian diinkubasikan di dalam inkubator CO2 dengan kandungan gas CO2 5%, suhu 37 °C, selama 72 jam.